극지고유 생물자원 확보 및 관리 - 극지역 및 아북극권에서 다양한 극지생물 확보(극지미생물, 유용식물 종자, 호냉성 미세조류) - “극지생물자원 DB” 구축 및 운영을 통한 효율적인 생물자원 관리 - 발현유전체 확보를 통하여 대사체 생산 및 적응생리기작 연구기반 확보 - 극지생물 활용을 위한 배양시스템 개발 및 운용 극지생물 유래 신규바이오소재 개발 - 청정공정에 활용할 수 있는 다양한 생체촉매 확보 및 재조합 발현시스템 확보 - 세포독성 조사를 위한 in vitro 시스템 확보 및 신규 물질의 독성평가 - 극지지의류로부터 이형 당뇨 저해활성 물질도출 및 활성검증 - 극지미생물로부터 신규 항동결바이오폴리머 도출 및 이용성 연구 - 극지지의류 유래 신규 항산화제 Ramalin 분리, 구조분석 및 합성연구 진행 - 극지 호냉성 미세조류의 확보 및 미세조류 유래 결빙방지단백질 대량 발현시스템 구축 - 극지 호냉성 미생물 확보 및 미생물 AB30 유래 결빙방지단백질 분리 남극 지질조사 및 해저자원 확보를 위한 기반연구 - 남극 남쉐틀랜드군도 북부지역에 대한 자료 처리 - 남극 남쉐틀랜드군도 북부지역의 지체구조도 및 BSR 분포도 작성 - 남극해에서의 지질 지구물리 조사 수행 - 남극에서의 지질조사, 지구물리 자료 추가 확보 및 탄성파 도면집 작성

세부목표 3.1

Cryo-Biotech(극지생물 활용기술 개발)

▣ 당초 계획한 기술적 연구목표는 100% 수준 달성

• 과학기술적 의의
  • 극지생물은 지구상 독특한 유전자원의 원천이며, 혹독한 극지환경에 적응하여 생명현상을 유지하는 생물?유전자원으로 미래 바이오산업의 유용한 소재로서 고도의 경제적 가치 제공
  • 극지역 생물자원 보호 강화에 따른 신규 자원확보의 한계성 극복을 위하여 배양 가능한 극지생물을 선점 및 이용
  • 극지생물에 기초한 생물공학 기술의 연구개발을 통하여 극지생물의 산업적 이용기술을 확보하고 산업적 가치가 내재된 생물자원 개발을 통한 국가 경쟁력 강화
• 파급효과
  • 유전자원, 분리환경, 및 유용물질 생산과의 관계 DB 개발 및 공개를 통하여 목적지향적인 시료채취와 성공률이 높은 유용물질 탐색방법을 확립
  • 난배양성 미생물 분리, 메타게놈 library 및 세포ㆍ조직배양을 통하여 극지생물로부터 유용 바이오신소재 개발 및 산업발전을 촉진
  • 발현유전체 확보 및 분석기술 구축으로 유전자 기능 및 저온적응 등의 연구와 다양한 대사체 생합성기작 연구를 통한 유용 바이오신소재의 도출
  • 극지 해저자원 연구를 통하여 극지자원의 평가 및 개발가능한 자원의 기반연구
  • 극지와 관련지역에서의 첨단 응용과학연구는 극지연 임무의 일환으로 극지유용생물 개발을 중장기 발전방향의 하나로 선정하여 국익 도모 및 국민생활 향상 기여

가. 극지고유 생물자원 확보

• 과학기술적 의의
  • 미발굴된 신종 및 신규 유전자 확보를 위한 원천기술 개발과 BT분야에서 산업화가 가능한 생물신소재 탐색 및 극지생물자원의 활용을 극대화할 수 있는 기반연구
• 파급효과
  • 난배양성 미생물, 메타게놈 library 및 배양 세포조직 등을 국내?외 연구진에 공개하여 유용 바이오신소재 개발에 기여
  • 극지역 생물자원의 현지 외 보존을 통하여 장기적인 생물자원 확보에 관련한 연구와 극한지 적응연구 및 계통분화에 대한 기초연구 지원
• 극지고유 유전자원 확보
  • 극지고유 생물자원 확보
    • 북극 다산과학기지 인근 해수, 토양, 담수 시료와 알프스 지역 빙하시료로부터 극지미생물 1,158 균주 확보
    • 생체촉매 탐식을 위하여 확보된 미생물 2,760 균주로부터 단백질분해 미생물 114주, 지질분해 미생물 429주, 키틴 분해 미생물 18주, 세포외다당체 생산 미생물 11주 분리
    • 몽골 흡수골 호수 남단지역으로부터 50여종의 유용 식물 종자 확보 및 동정 완료
    • 배양이 불가능한 생물체의 유전자 정보를 확보를 위한 메타게놈 library를 구축하여 11Mb의 메타게놈을 확보(450Mb/3년)
    • 신종 미생물 4균주(IMCC3175, IMCC3223, IMCC3295, IC3113)의 다상분류를 통해 신종 미생물 등록
  • 확보된 극지생물자원의 다양성 연구
    • 기확보 극지고유 미생물 400주의 계통학적 종 동정조사를 통하여 총 1,583균주의 미생물에 대한 속 수준의 분류 완료
    • 북극해 5개 정점에서 해양 미생물 약 1,000개 클론을 확보, 총 524개의 대표 클론에 대한 염기서열 정보 확보 및 클론 염기서열의 계통학적인 분석을 통해 북극 미생물의 분자군집구조 분석
    • 세종과학기지 근처와 칠레 푼타아레나스 지역에서 남극이끼류 59점 확보(49종 동정) 및 종다양성 조사

나. 기능성 유전자 분석 및 이용성 확보

• 과학기술적 의의
  • 분자수준의 극지생물 생명현상, 유용유전자 확보 및 기능연구를 위하여 생화학적?분자생물학적 연구기법 이용
  • 유용물질 생산을 위한 남극좀새풀과 북극 이끼로부터 발현유전체를 분석 및 적응기작 연구를 위하여 환경요인에 따른 유전자 발현 양상 분석 및 유용유전자 염기서열 확보
• 파급효과
  • 극지생물 발현유전체 정보는 “극지생물자원 DB”에 연계하여 극지생물 적응기작, 유용 효소 탐색 및 생리활성 물질과 관련한 유전자 탐색 및 유전자 기능연구에 기초정보 제공
  • 극지 고유생물의 발현유전체를 확보함으로써 유용유전자를 도출 및 분자적 수준의 극지생물연구 분야에 도약적인 발전 유도
• 극지생물 발현유전체 분석과 물질생산 관련 유전자 확보
  • 북극 이끼류 Aulacomnium turgidum 발현유전체 분석
    • cDNA library 제작을 통하여 총 509개의 cDNA의 염기서열을 분석, 확보된 발현유전체중 기능이 밝혀진 유전자들을 중심으로 Gene Ontology 분석을 통한 기능별 분류

      Aulacomnium turgidum 발현유전체의 기능적 분류

  • 대표적 남극 현화식물인 Deschampsia antarctica 발현유전체 분석
    • 남극좀새풀로부터 cDNA를 합성, pyrosequencing으로 약 37만 반응의 염기서열 분석을 수행하여 78.5Mbp의 염기서열 정보 획득, assembly 과정을 통해, 전체 60,765개 발현 유전체 정보 확보, COG 분석을 통하여 기능별 유전자 분류 및 기능 관련 유전자 탐색을 위하여 마이크로어레이를 이용한 생물정보학적 분석 수행(세계적으로 최초로 시도되며, 다양한 생리작용에 대한 연구기반 확보)
• 극지생물 발현유전체를 활용한 유전자 발현 분석
  • 북극 이끼류 A. turgidum 유전자 발현 분석
    • 저온 관련 유전자 rare-cold inducible 2a와 2b, enhanced susceptibility 5, 고온과 산화적 스트레스 관련 유전자 26S proteasome regulatory subunit S2 1A와 heat shock protein 60, trehalose 대사의 변화를 매개하는 trehalose-6- phosphate synthase, 고염도에 발현되는 choline kinase 등의 유전체 발현양상 분석
  • 남극현화식물 D. antarctica 의 유전자 발현 분석
    • 극지 환경에서 적응과정에 필수적인 유전자들을 탐색하고자 cDNA Macroarray 기법으로 환경요인의 변화에 따른 유전자의 발현 양상을 대규모로 분석 및 발현분석
  • 친환경적인 NAG 공정생산을 위한 생체촉매 확보
    • 화학공정을 대체하는 친환경 생채촉매 공정개발을 위하여 KOPRI 21698 endochitinase(dimer 생산) 및 KOPRI 22718 exochitinase(monomer 생산) 생산 유전자를 확보하고 특성을 분석

다. 극지생물의 진화학적 기원연구

• 과학기술적 의의
  • 남극대륙 및 주변지역에 서식하는 지의류의 지역적 분포 및 진화학적 유연관계 규명
• 파급효과
  • 극지지의류의 남극지역 적응기작 연구 및 기후변화에 따른 지리적 이동 등의 연구를 위한 기초자료로 활용
• 극지생물의 계통진화학적 특성연구
  • 남극대륙 및 킹조지섬에 서식하는 지의류 Pseudephebe, Umbilicaria, Usnea 속의 계통진화학적 기원연구를 통하여 “남극대륙 태평양 연안지역의 지의류는 지역적인 격리와 관계없이 유전적인 계통을 공유함”과 “킹조지섬에 서식하는 지의류는 대륙에 서식하는 지의류와 유전적으로 독립적인 계통을 유지하며, 남극에서 지의류의 분포는 이동성의 제한보다는 서식환경에 대한 적응이 더 중요하게 작용”한다는 것을 밝힘

    남극대륙 및 킹조지섬에 분포하는 Usnea 속 지의류의 계통분석

라. 극지미세조류 확보, 분자 계통학적 분류 및 보전

• 과학기술적 의의
  • 극지 미세조류 20종과 해양 미생물 수종의 성공적 추가 확보 및 분자생물학 기법을 이용한 극지 미세조류 연관 미생물의 종 다양성 연구
• 파급효과
  • Melting pond에서의 ice algae의 확보로 극지 미세조류 배양실의 양적, 질적 수준 향상
  • 분자생물학 기법을 이용한 극지 미세조류 연관 미생물의 군집구조 비교 연구를 통하여 신규 분류군 발견, 극지 생물자원의 확보 및 활용성 증대
• 극지미세조류 확보, 분자계통학적 분류 및 보전 성과
  • 2008년 4월 북극 다산과학기지 주변 Kongsfjorden 지역에서 미세조류 확보 및 순수분리 (24종 추가)
  • 2008년 8월 중국쇄빙선 설룡호를 통한 북극시료채집 실시
    • Melting pond에서 얼음 밑에 부착해있는 sea ice 미세조류 및 해양성 미생물 확보 (10종 추가)
  • 극지 식물플랑크톤 배양체로부터 신종 미생물 분리
    • 남극해 유래 AnM0046에서 신종 미생물 Anm46-CL-AP4와 Anm46-CL-AP6를분리
    • 신종 16S rRNA 유전자의 염기 서열 분석 및 생리, 화화적 특성 파악
  • 극지 미세조류로부터 친저온성 미생물의 자원 확보 및 분자생물학 기법을 이용한 미생물의 종 다양성 연구
    • DGGE 기법과 qPCR을 이용하여 미생물 군집구조 비교 연구 결과, 18개 미생물 phylotype 확인
    • 식물플랑크톤 AnM0008와 AnM00046에 공존하는 미생물의 종조성을 조사한 결과, 미생물 군집이 다양함을 밝힘

    현재 순수 분리 배양 시도중인 북극산 미세조류

마. 극지고유 생물소재 이용성 확보

• 과학기술적 의의
  • 바이오소재 탐색기술을 이용하여 친환경 공정용 저온효소, 기능성 화장품 및 의약품 분야의 신규물질을 도출하고 활용연구를 통한 극지생물 유래 신소재 활용연구 기반확보
• 파급효과
  • 새로운 생체기능을 가지는 극지생물의 확보와 이용기술의 개발을 통하여 생체 개량기술의 개발 및 공정기술 등의 기술혁신에 기여
  • 극지생물 연구 인프라 구축을 통하여 국내 바이오산업 관련 기업, 연구소 및 대학에 기초연구 자료를 제공하고, 공동연구를 통한 신규 바이오산업 창출
  • 극지생물의 산업적 이용기술을 확보하고 산업적 가치가 내재된 생물자원 특허를 보유함으로서 국가 경쟁력을 강화하고 선진국의 기술개방 압력에 대응
  • 혹독한 극지환경에 적응하여 생명현상을 유지하고 있는 극지생물체의 생명기능은 원천적 생물?유전자원으로 미래 바이오산업의 유용한 소재로서 고도의 경제적 가치를 제공
• 극지생물 유래 신규 바이오소재 탐색 및 확보
  • 공정효소용 저온활성 dioxygenase 확보
    • 알프스 오염토양, cryconite로부터 benzoate 분해성 균주 17개 분리, 벤젠고리화합물 분해능 검증 및 anthranilate/benzoate dioxygenase 효소의 활성부위를 코딩하는 유전자 염기서열 확보
  • NAG 생산 공정효소용 생채촉매 개발
    • Chi21718 : 북극 Cara Sea에서 분리한 저온성미생물 Pseudoalteromonas issachenkonii KOPRI 22718로부터 분자량이 약 100kDa인 Chi22718에 대한 공정이용성, monomer 생산관련 저온활성, 온도 안정성, 기질 반응성 등의 특성 조사 및 염기서열 분석
    • Chi21702 : 남극에서 분리한 해양성 저온미생물인 Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702로부터 분자량이 57kDa인 Chi21702에 대한 공정이용성, monomer 생산관련 저온활성, 온도 안정성, 기질 반응성 등의 특성 조사 및 염기서열 분석
    • NAG 생산 공정효소용 생채촉매 생산 : 과발현되는 E. coli Chi21702 재조합 생산주 개발(16.5U/mg) 및 효모 단백질 발현시스템을 이용한 재조합 생산주 개발 및 유전자서열 재조절(codon optimization)을 통한 생산성 향상
  • 이형당뇨 치료제 관련 신규 물질의 세포독성 평가
    • 인간피부의 진피유래 섬유세포 keratinocytes의 배양세포인 HaCaT과 표피유래 각질세포 fibroblasts의 배양세포인 CCD-986SK에서 MTT assay를 이용하여 PTP1B 저해제 신규물질인 Ohioensin-F, G, Stereocalpin, Usnamine-A ,B, C의 세포독성결과 Ohioensin-F, Usnamine-B 이용이 가능한 농도범위 유지
    
    

    【 이형당뇨 관련 신규물질의 세포독성 】

    Sample	SC80(㎍/㎖)	IC50 (㎍/㎖)
    Ohioensin-F	2.49	14.95
    Ohioensin-G	>90	>90
    Stereocalpin	>90	>90
    Usnamine-C	1.85	>90
    Usnamine-A	1.85	>90
    Usnamine-B	0.79	>80

    
     
  • 극지생물 유래 신규 항산화 물질개발
    • 남극 이끼류 Polytrichastrum alpinum의 신규 화합물인 Ohioensins F와 G의 항산화 활성 조사 결과, 신규물질 Ohioensins F 및 G의 항산화 활성은 아래 표와 같으며, 의약품 및 기능성 향장소재로 이용 가능
    • 남극 지의류 Ramalina terebrata의 신규 항산화제 도출 : Ramalin은 분자량 254.1, 분자식 C11H16N3O4 이며 수용성이며 독성검사 결과 이용이 가능한 신규 화합물질로 확인, 기존 시판되는 항산화제보다 월등히 뛰어난 항산화효과를 가지고 있으므로, 산화 관련 질환 치료제나 노화방지용 기능성 식품, 미백 및 주름개선용 기능성 화장품 등에 활용이 가능하며, 합성이 가능하여 대량생산이 가능함

      Ramalin의 구조

      
      

      【 Ramalin과 상용화 항산화제와의 활성 비교조사 】

      상용화 항산화제	IC50 농도 (μg/mL)				Reducing Power(1 μg of BHT equivalent)
      	DPPH (μg/mL)	ABTS+(μg/mL)	Superoxide (μg/mL)	Tyrosinage activity (μg/mL)
      Ramalin	0.99±0.08	1.7 ±0.2	10.2±1.2	4±0.4	0.04±0.003
      BHA	4.97±0.9	-	-	-	-
      Trolox	-	46.35±5.1	-	-	-
      Ascorbic acid	-	-	12.7±1.2	-	-
      Kojic acid	-	-	-	5±0.5	-

      
       
    • MTT assay를 이용하여Ramalin의 세포독성 조사 결과, HaCaT과 CCD-986SK에서 80%의 세포생존율을 결정하는 농도(SC80)가 HaCaT에서 2㎍/㎖으로 조사되었으며, Comet assay에 의한 세포 내 항산화활성 조사 결과, 세포손상이 현저히 감소되는 것으로 조사

      【 HaCaT 세포를 이용하여 Comet assay에 의한 Ramalin의 세포내 항산화 활성 검증 】

      Blank(PBS)	H2O2 100uM
      Ramalin 2㎍/㎖	Ramalin 50㎍/㎖
      H2O2 100uM + Ramalin 2㎍/㎖	H2O2 100uM + Ramalin 50㎍/㎖/TH>

  • 극지생물 유래 이형당뇨치료용 PTP1B 저해물질 도출
    • 남극 지의류 Umbilicaria antarctica의 MeOH 추출물로부터 PTP1B 저해 활성을 나타내는 순수한 활성물질 3종(Uma-4-2:methyl orsellinate, Uma-4-3:lecanoric acid, Uma-4-4:gyrophoric acid) 도출, gyrophoric acid의 경우, positive control로 사용한 ursolic acid와 유사한 강한 저해 활성, PTP1B 억제효과 메커니즘을 확인한 결과 non-competitive 억제제 확인
    • 남극 지의류 Stereocaulon alpinum의 MeOH 추출물로부터 PTP1B 저해 활성을 나타내는 순수한 활성물질로 1종의 depsidone형(lobaric acid 화합물 1), 2종의 pseudodepsodone형(화합물 2,3)을 분리, depsidone과 pseudodepsidone형 화합물 1-3은 모두 micromolar 수준에서 PTP1B의 효소활성을 억제 확인, PTP1B에 대한 강한 억제활성을 나타내는화합물1 (lobaric acid)와 pseudodepsidone 화합물 2의 억제효과 메커니즘을 확인 결과, non-competitive 억제제 확인
  • 항동결 바이오폴리머(P-21653)의 이용특성 규명
    • 동물세포인 CHO-K1 cell에 대한 P-21653의 동결보호 특성조사 결과% Glycerol과 동물세포전용 동결보호제인 RecoveryTM 보다 P-21653이 CHO cell에 대한 동결보호효과가 비교적 우수하여 동물세포보존제로 이용 가능

바. 저온 결빙방지 활성물질 탐색

• 과학기술적 의의
  • 저온 결빙방지 활성물질 순수 분리 및 호냉성 미세조류의 cDNA library 구축
• 파급효과
  • 저온 결빙방지단백질(AFD) 순수 분리를 통해 제대혈 은행, 줄기세포 회사, 관련 학계 등과 활발한 공동연구 추진
• 저온 결빙방지 활성물질 탐색 성과
  • 극지 호냉성 미세조류 Chaetoceros neogracile의 결빙방지단백질 특허출원
    • C. neogracile의 결빙방지단백질 유전자를 확보하고, 대장균내에서 이 유전자의 성숙전 단백질과 성숙된 단백질 발현시스템을 구축하여, 결빙방지단백질을 대량으로 발현
    • 발현된 단백질을 정제하고 활성을 측정한 결과, 야생형과 동일한 활성을 가지는 것으로 밝혀짐

      성숙-전 (Pre-mature) IBP 단백질	성숙 (Mature) IBP 단백질

  • 극지 호냉성 미생물 AB30의 결빙방지단백질
    • 휴림바이오쎌과 공동으로 진행중인 AB30 활용연구에서 줄기세포 동결보존시 AB30의 결빙방지단백질을 첨가한 경우, 동결보존후 세포의 생존률 및 분화율이 증가하는 것으로 나타남. 특허 및 제품화 추진중

      분리정제한 AFP 단백질과 줄기세포의 동결보존 실험

  • 남극 호냉성 미세조류 KOPRI AnM0046의 cDNA library 구축 및 유전자 분석 연구 진행중
    • 정상적 배양환경(2℃)에서의 배양시료와 저온충격환경(-2℃)하에서의 배양시료를 cDNA library를 구축하였으며 각각 1,000개의 유전자를 분석
    • cDNA library에서 posttranslational modification, protein turnover, chaperones에 관련된 유전자가 가장 많은 것으로 분석
    • 극지 미세녹조류에서 결빙방지단백질 2종의 유전자 서열 처음으로 규명

사. 극지생물자원 DB개발 및 운영

• 과학기술적 의의
  • 극지생물의 분포, 생태학적 환경특성, 생리활성, 계통진화를 상호 비교연구하여 극지생물의 진화 및 적응과정을 연구할 수 있는 기반 확보
• 파급효과
  • 2008년 DB 구축완료, '09년 연구소내 시험가동 후 일반에 공개. 극지의 환경정보, 분류학적 생물다양성 정보, 배양조건 등 생리적 특성, 생리활성물질 생산 등의 정보를 함유하여 활용성 증대
  • 수집한 생물자원의 목록작성 및 현황파악을 통하여 서식처 및 물질간 관계형 DB를 개발하고 국내?외 연구진에 공개, 분양하여 신규 유용물질 개발을 위한 정보제공
• 극지생물자원 DB 구축과 운영 성과
  • 극지연에서 보유하고 있는 생물자원 및 생물다양성 정보를 효율적으로 관리하기 위한 DB 구축을 위하여 DB 프로그램 작성 완료 및 서버 구축. 핵심 DB를 완성하여 시료 및 미생물 균주 자료를 입력하였으며, 핵심 DB와 연동하여 작동하는 분류정보 DB, 배지 DB, 참고문헌 DB, 학명 DB 프로그램 작성 완료

    시료 DB의 메인화면 및 개별시료의 입력창

세부목표 3.2

극지해저지질 특성연구

가. 고해상도 탄성파 자료 획득(750L-km)

• 과학기술적 의의
  • 남극은 자원의 보고(550억 배럴의 석유, 221조m3의 천연가스 부존)로서, 고해상도 해저지층탐사 자료를 획득하여 향후 남극 해저자원 개발에 대비함
  • 남극반도 북동해역의 가스하이드레이트 퇴적층 분포를 확인함으로써, 자원도 작성에 기초 자료를 제공할 수 있음
• 파급효과
  • 향후 남극 해저자원 확보를 위한 기초자료 제공 및 해저자원조사 기술 축적
  • 남극반도 해저지층 형성과정에 대한 첨단 연구결과 도출
  • 남극반도 해저자원 유망부존지역 선정

나. 해저퇴적물 시추코아 획득 (3정점)

• 과학기술적 의의
  • 남극반도 북동해역의 퇴적환경 연구
  • 퇴적물 분석을 통한 해저자원환경 판단
  • 남극반도 북동해역의 고해양/고기후 복원
• 파급효과
  • 남극반도 해역의 해양퇴적환경 이해
  • 표층퇴적층의 유기물 분석을 통한 해저자원 형성 가능성 평가
• 중력시추코어를 이용한 연구지역 북동대륙 주변부의 표층퇴적물 채취
  • 빙상 전진/후퇴에 의해 운반된 빙하퇴적물과 침식에 의한 퇴적작용
  • 남극반도 주변 해류의 변동에 영향을 받은 표층퇴적물 채취

다. 탐사 자료 DB 구축 및 자원환경도 작성

• 과학기술적 의의
  • 남극반도 탄성파 자료의자료 정보를 파악
  • 남극반도 북동해역의 가스하이드레이트 분포 파악
• 파급효과
  • 국내 과학자들의 남극자료 이용 활성화
  • 체계적 자료 축적을 통해 남극 광역해저자원도 작성 가능
  • 향후 해저자원 개발시점에 기초자료 제공
  • 남극 개발시점에서 우리나라 전략적 진출지역 선정에 활용
  • 남극에 대한 우리나라 과학적 연구성과 향상
• 남극 해저지질 탐사자료 DB 구축 및 자원환경도 작성
  • 1994년이후 남극 해저지질조사 사업의 탄성파 자료 DB 구축
  • 남쉐틀랜드군도 북동대륙 주변부의 탄성파 해석도 작성